Cjepivo BioNTech/Pfizer, poznato i pod nazivima BNT162b2, tozinameran ili Comirnaty^®, namijenjeno cijepljenju protiv COVID-19, u posljednjem tjednu 2020. je krenulo u dugo iščekivanu primjenu diljem svijeta. Današnji članak početak je analitičkog triptiha, trodijelnog teksta o građi i funkciji BioNTech/Pfizer cjepiva, a u prvom nastavku analizira njegove genetičke osnove i biokemijski sastav.

Cjepivo bez fige u džepu

Unatoč medijskom praćenju kakvo do sada nije imao niti jedan farmaceutski proizvod u povijesti (osim možda Viagre – a i ona je Pfizerovo (ne)djelo), te usprkos tome što je svaki korak proizvodnje, pretkliničkog i kliničkog testiranja cjepiva bio stavljan pod povećalo javnosti i nemilosrdno analitički diseciran od tisuća stručnjaka i milijarde strućljaka, dakle nasuprot svim čvrstim, dokumentiranim dokazima da je cjepivo znanstveno utemeljeno, klinički provjereno i po svim suvremenim biofarmakološkim standardima kvalitetno, ipak i dalje protiv cijepljenja postoji snažan otpor u tzv. antivakserskim i skeptičnim krugovima.

Jer, da citiramo samo neke od njihovih često korištenih spinova: „…od javnosti se skriva što se zaista nalazi u njemu“, „…cjepivo je neprovjereno“, „…potpuno je nepoznat mehanizam njegovog djelovanja“, pa sve do „…mRNA iz cjepiva uzrokuje primjene u ljudskoj DNA i time mutira naše gene, što će imati nesagledive posljedice u budućnosti“.

Najbizarnija u svemu jest činjenica što je BNT162b2 mRNA cjepivo u biokemijskom, genetičkom i farmakološkom smislu u stvari vrlo jednostavnog sastava, lako dostupnog analizi u svakom bolje opremljenom laboratoriju u svijetu. Povrh svega: svi, pa i oni najsitniji molekularni detalji sastava i građe cjepiva su u potpunosti dostupni javnosti (tehnologija mu je open-source based, rekli bi informatičari). Svaka tvrdnja koju iznose skeptici potpuno je provjerljiva (i provjereno netočna), a dokazi su dostupni i razumljivi svakoj pismenoj osobi s temeljnim predznanjem biologije i genetike.

Uostalom, bacimo zajednički detaljni pogled na dvije ključne karakteristike mRNA BioNTech/Pfizer SARS-CoV-2 cjepiva: njegov sastav (uključivši step-by-step analizu kôda mRNA) i biološki mehanizam njegovog djelovanja na razvoj imuniteta protiv SARS-CoV-2 virusa. Baš je lako, može svatko!

Uvod: osnovi pojmovi genetike cjepiva

Geni su građeni od dvostruke zavojnice zvane DNA, deoksiribonukleinska kiselina, koja je dvolančana spiralna molekula sastavljena od jednostavnih osnovnih građevnih elemenata. Vrlo usporedivo s računalom, DNA predstavlja svojevrstan digitalni kôd, programsku informaciju i instrukciju koju naše stanice „očitavaju“ i izvršavaju kodirane naredbe kako bi cijeli organizam svrhovito funkcionirao i održavao se u životu. Čitanje i izvršavanje genskog kôda zapisanog u DNA doslovce i jest – život.

O evolucijskom razvoju strukture i funkcioniranja genskog kôda DNA više pročitajte u izvrsnom članku Nenada Raosa.

Za razliku od računala koja koriste binarni kôd (nizove nula i jedinica), život koristi četiri osnovna nukleotida ili baze A, C, G i U/T (adenin, citozin, gvanin i uracil/timin) koji grade „prečke“ na zavijenoj ljestvici molekule DNA i služe kao osnovni strukturalni elementi genskog kôda.

U računalima nule i jedinice očitavamo i (privremeno ili trajno) pohranjujemo u obličju prisutnosti ili odsutnosti elektronskog naboja, napona, protoka struje ili modulacije signala. Dakle, 0 i 1 nisu nekakav apstraktni koncept: oni „žive“ u formi elektrona ili drugih fizikalnih utjelovljenja. Te nule i jedinice u računalima obično grupiramo u skupinu od 8 bitova (bajt), tipičnu jedinicu podataka koja se obrađuje.

S druge, biološke strane priče o kôdovima, u jezgri svake naše stanice nalaze se nukleotidi A, C, G i U/T, molekule nanizane u jednostruke (RNA) ili dvostruke (DNA) lance. Umjesto računalnih bajtova, biologija grupira 3 nukleotida u jedan kodon, tipičnu jedinicu biološke obrade podataka. Kodon sadrži 6 bita informacije (2 bita po jednom DNA nukleotidu; 3 znaka = 6 bita, što čini 2⁶ = 64 različite vrijednosti kodona).

Analogno i digitalno cjepivo

Sve do pojave mRNA-cjepiva, osnovni princip cijepljenja (vakcinacije) bio je stimulacija našeg imunološkog sustava za borbu protiv patogena (uzročnika bolesti) na način da se taj patogen „prezentira“ našem imunološkom sustavu, ali tako da tijekom tog procesa učenja ne obolimo od uzročnika protiv kojega se učimo boriti. To se u dosadašnjim antivirusnim cjepivima izvodilo ubrizgavanjem oslabljenog ili onesposobljenog (atenuiranog), odnosno razgrađenog (mrtvog) virusa, uz dodatak adjuvansa (pomoćnih tvari) kojima je uloga poticanje našeg imunološkog sustava na akciju.

Ta tehnika je po svom karakteru (da ponovo usporedimo s računalima) „analogna“, jer podrazumijeva korištenje milijarde umrtvljenih ili razgrađenih virusa u otopini koja osim točne informacije potrebne našem imunološkom sustavu sadrži i veliku količinu nepotrebnog „šuma“, tj. kemijskih adjuvansa, pa i onih "suvišnih" dijelova virusa koji se nalaze u cjepivu, ali našem imunološkom sustavu ne donose nikakav koristan kôd.

S druge strane, novo mRNA cjepivo obavlja posve isti zadatak: ono „educira“ naš imunološki sustav za borbu protiv patogenog uzročnika, ali na „digitalni“, laserski precizan način, pri čemu mislimo na oba značenja riječi „laserski“ - vrlo precizno, ali i vrlo moćno.

Kako dakle funkcionira mRNA cjepivo?

Prvo razjasnimo koja je uopće biološka uloga sâme ribonukleinske kiseline, RNA. Glasnička (messenger) RNA ili mRNA igra ključnu ulogu u ljudskoj biologiji: ona kodirane upute (pohranjene u dvostrukoj zavojnici DNA u formi gena) prenosi s DNA u ribosome, stanične „tvornice“ koje „čitaju“ kôd zapisan u mRNA i po tim uputama proizvode proteine potrebne u svakoj živoj stanici. Korištenje mRNA kao lijeka ili cjepiva je načelno jednostavan postupak: u stanicu je potrebno ubaciti laboratorijski dizajniranu mRNA koja predstavlja precizno kodiranu instrukciju za upućivanje vlastitih stanica pacijenta da proizvode proteine koji mogu spriječiti, liječiti ili izliječiti bolest.

mRNA koja se nalazi u cjepivu je - kako smo slikovito rekli - digitalna, tj. uopće ne sadrži dijelove virusa, nego 4284 znaka dugačke molekule RNA koje nose digitalni kôd (poruku, message, od čega i dolazi naziv „mRNA“ – messenger RNA) koji u sebi nosi samo jednu, laserski preciznu informaciju: instrukciju za produkciju molekule spike-proteina iz vanjske ovojnice SARS-CoV-2 virusa. Spike-protein je odabran kao ciljna molekula za djelovanje cjepiva jer predstavlja ključni dio virusa odgovoran za prepoznavanje i pokretanje naše imunološke obrane protiv tog virusa.

Sâm spike-protein SARS-CoV-2 virusa ne uzrokuje Covid, nego je vanjski dio virusa kojega naš organizam koristi za prepoznavanje „neprijatelja“. Cjepivo tu kodiranu informaciju o građi ključnog dijela virusa unosi u naše stanice u obliku mRNA, a naše stanice – „čitajući“ kodiranu poruku iz mRNA – započinju s proizvodnjom čistog spike-proteina u količinama dovoljnim da ga naš imunološki sustav prepozna, pokrene se i snažno aktivira.

Suočen sa spike-proteinima i, što je vrlo važno, lažnim ali stimulativnim signalnim znakovima da su stanice „napadnute“, naš imunološki sustav razvija snažan odgovor na spike-protein. Već desetak dana nakon cijepljenja, imunološki odgovor je toliko spreman, da pri kontaktu sa SARS-CoV-2 virusom prepoznaje spike-protein u njegovoj vanjskoj ovojnici i odgovara uništavanjem cijeloga virusa, žestoko i vrlo učinkovito. Točnije rečeno, kako ste vjerojatno već pročitali u medijima, oko 95% učinkovito.

Proizvodnja mRNA, standarnda verzija: enzimska konverzija

Kako je navedeno, mRNA u cjepivu protiv SARS-CoV-2 virusa u suštini je jednostavan digitalni kôd dug samo 4284 znaka. No, kako se u laboratoriju stvara i proizvodi mRNA koja sadrži tako precizan kôd? Postoje dva osnovna načina, od kojih je jedan već godinama uhodan laboratorijski postupak za enzimatsko konvertiranje DNA u RNA, a drugi predstavlja state-of-the-art tehnologiju biološkog 3D-printinga u kojem se RNA sintetizira od njenih osnovnih građevnih elemenata.

Trenutno standardni laboratorijski postupak za „proizvodnju“ mRNA je korištenje enzimskih sustava za „krojenje“ željenog kôdnog zapisa. On ide u nekoliko koraka: u laboratoriju se prvo pročišćena virusna RNA (SARS-CoV-2 je RNA virus, to već znate, ne?) pomoću enzima konvertira u DNA. Iz te DNA se potom odabere samo gen od interesa – u ovom slučaju gen koji kodira proizvodnju virusnog spike-proteina. Taj gen se potom ubaci u posebne sojeve bakterija koje u laboratoriju služe kao „tvornice“ za proizvodnju velike količine takvih gena.

Na taj način se umnoži velik broj gena (komadića DNA koji nose instrukciju za proizvodnju proteina), a potom se posebnim enzimima ta dvolančana DNA ponovo konvertira u jednolančanu mRNA, koji nadalje ima ulogu nositelja kôda za proizvodnju spike-proteina.

Ako nastavimo s informatičko-računalnim metaforama, DNA je glavni kôd, kernel, operativni sustav našeg organizma, set instrukcija koji je predviđen da aplikacijski, izvršni programi (u našem organizmu RNA) iz njega prepisuju i izvršavaju naredbe, ali obrnuti smjer kodiranja ne postoji: kao što aplikacije načelno ne mijenjaju source-code operativnog sustava, tako ni RNA ne može izmijeniti osnovnu genetičku strukturu naše DNA. Štoviše, onako kako za operativne sustave postoje antivirusne i antimalware protektivne aplikacije, tako i naša DNA posjeduje snažan protektivni sustav koji prepoznaje i "popravlja" maliciozne pokušaje izmjene genoma. O tome više u idućem, drugom nastavku ove trilogije.

Proizvodnja mRNA, alternativna verzija: bio-printing

Nakon što je biokemijska i genska građa spike-proteina tijekom prvih mjeseci 2020. godine točno definirana, genetičari su – poput kompjutorskih programera – napisali kôd (sastavljen od – sjetit ćete se! – trojki nukleotidnih parova nazvanih kodon) koji nosi preciznu uputu za proizvodnju spike-proteina u stanicama, tj. kôd koji definira mRNA, prenositelja „poruke“ o spike-proteinu.

Taj kôd od 4284 znaka potom se ispiše na digitalni medij, te učita u bio-printer (baš tako, u biološki 3D-printer sposoban za ispisivanje mikroskopskih molekula veličine DNA), koji bajtove (kodone) s digitalnog medija pretvara u stvarne DNA molekule. Umjesto „tinte“, za printanje DNA se kao građevni materijal koriste molekule, sjetit ćete se i koje: adenin, citozin, gvanin i timin/uracil. Iz tog bio-printerskog stroja naposlijetku izlaze željene sekvencije DNA, koje nakon enzimske obrade (vidi ranije u tekstu!) završavaju kao mRNA u bočici sa cjepivom. Dakle, mRNA koja se nalazi u cjepivu se ovim postupkom generira from the scratch, uzajamnim spajanjem čistih građevnih molekula za izgradnju gena.

Detaljnije podatke o BioXp ™ 3250 bio-printeru pogledajte u okviru uz tekst i na popratnom linku.

Digitalizacija vakcinacije

Pažljiviji čitatelj će opaziti kako nijedan od navedenih načina laboratorijske proizvodnje cjepiva ne koristi nikakav oblik uzgajanja DNA i RNA na (u medijima i društvenim mrežama često spominjanim) kokošjim jajima, stanicama mrtvih ili živih fetusa, šišmiševim testisima ili prahu žabljih rogova. Upravo suprotno, cjepivo je po svojem sastavu vrlo jednostavna i čista otopina samo nekoliko vrhunski pročišćenih kemikalija, i u tom smislu je praktički "digitalno", da još jednom iskoristimo taj izraz.

Doza od 30 µg uistinu sadrži točno 30 mikrograma mRNA. Uz to, molekule mRNA su „umotane“ u lipidni sustav pakiranja pomoću kojega se mRNA unosi u naše stanice. Svaki kodni znak unutar mRNA težak je otprilike 0,53× 10^-21 grama, što znači da u jednoj dozi od 30 mikrograma ima 6×10¹⁶ znakova, što je pak oko 25 petabajta (PB) informacija.

No, valja napomenuti da se ta ogromna količina podataka u jednoj dozi ustvari sastoji od oko 2000 milijardi ponavljanja istih 4284 znaka. Stvarni informacijski sadržaj cjepiva (podatak o građi spike-proteina) iznosi nešto više od 1 kilobajta (1 KB). Poznat je i kompletan genom cijeloga SARS-CoV-2 virusa (a ne samo spike-proteina): velik je oko 7,5 kilobajta.

RNA je svojevrsna nestabilna verzija DNA, odnosno nešto poput njene "radne memorije". Biološka DNA se može usporediti s flash-memorijom: vrlo je izdržljiva, interno redundantna i prilično pouzdana. Međutim, kao što računala ne izvršavaju binarni kôd izravno s flash-memorije, nego se kôd prethodno kopira u brži, svestraniji, ali i daleko krhkiji sustav, sa zapanjujućom sličnošću se ponaša i genski kôd: ono što je za računala radna memorija (RAM), za biologiju je - RNA. 

Za razliku od flash-memorije, RAM je konceptualno vrlo kratkog trajanja. Razlog zbog kojeg se mRNA Pfizer/BioNTech cjepivo mora čuvati na ekstremno niskim temperaturama je isti: RNA je krhki i osjetljivi cvijetak. Stoga je, uz nisku temperaturu pohranjivanja, u otopinu cjepiva potrebno staviti nekoliko stabilizacijskih i zaštitnih spojeva koji čuvaju mRNA od razgradnje, kao i lipidne dodatke koji poboljšavaju biološku raspoloživost mRNA nakon unošenja u organizam. O točnom kemijskom sastavu cjepiva pogledajte okvir uz tekst.

U drugom nastavku ovoga serijala o građi i funkciji cjepiva protiv COVID-19, pozabavit ćemo se biološkim učinkom cjepiva: prikazat ćemo kako cijepljenje uzrokuje stvaranje imunološkog odgovora i stvaranje dugotrajne imunološke memorije (i zaštite) od infekcije SARS-CoV-2 virusom

Treći nastavak će biti poigravanje reverznim inženjeringom: s obzirom na to da su svih 4284 kodnih znakova javno dostupni (dakle potpuno je poznat genomski redoslijed kodona u mRNA), njihovim „čitanjem“ je moguće do u posljednju kodnu liniju analizirati građu i funkciju svakog dijela mRNA u cjepivu. Upravo to ćemo zajednički i učiniti.

Do idućeg nastavka, upratite nas za više genetičkih receptura!

^{Igor „Doc“ Berecki je pedijatar-intenzivist na Odjelu intenzivnog liječenja djece Klinike za pedijatriju KBC Osijek. Od posla se opušta antistresnim aktivnostima: od pisanja svojevremeno popularnih tekstova i ilustracija u tiskanom izdanju časopisa BUG, crtkanja grafika i dizajna, zbrinjavanja pasa i mačaka, fejsbučkog blogiranja o životnim neistinama i medicinskim trivijama, sve do kuhanja upitno pitkih craft-piva i posve probavljivih jela, te sviranja slabo probavljivog bluesa.}